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绪论1

一、发酵工程实验的特点1

（一）发酵工程实验的目的和要求1

（二）实验室的一般要求2

二、发酵工程实验室的特点与要求3

（一）发酵工程实验的特点3

（二）发酵工程实验的要求3

（三）发酵工程实验室的安排5

三、发酵工程实验设计（方案）的基本步骤5

（一）实验设计（方案）的内容及要求5

（二）实验设计（方案）的拟定步骤6

（三）数据回归分析22

四、发酵工程实验常用的设备22

（一）摇瓶22

（二）摇床23

（三）发酵罐26

第一部分 基本技能实验31

第一章 菌种改造31

第一节 菌种分离纯化和自然选育31

第二节 微生物的诱变育种32

（一）诱变育种步骤32

（二）物理诱变与化学诱变34

第三节 富集培养技术在育种中的应用37

（一）抗性突变株的富集37

（二）营养缺陷型的富集38

第四节 原生质体育种41

（一）标记菌株的筛选41

（二）原生质体的制备42

（三）原生质体的再生43

（四）原生质体的融合44

（五）融合子的选择45

实验一 菌种的分离纯化45

实验二 紫外诱变48

实验三 微波诱变51

实验四 亚硝基胍诱变53

实验五 噬菌体的分离和测定54

实验六 抗噬菌体菌种选育57

实验七 氨基酸抗反馈调节突变株的选育60

实验八 大肠杆菌营养缺陷型的筛选63

实验九 原生质体制备及再生65

实验十 原生质体融合68

第五节 基因组改组技术69

第六节 微生物基因工程技术及其在微生物育种中的应用70

（一）目的基因的获取70

（二）克隆载体的选择与构建71

（三）外源基因与载体的连接71

（四）重组DNA导入受体细胞72

（五）重组体的筛选72

（六）克隆基因的表达72

（七）PCR技术扩增目的基因73

实验十一 基因组改组技术筛选蛋白酶高产菌株77

实验十二 基因组DNA的提取80

实验十三 煮沸法快速提取质粒DNA83

实验十四 碱裂解法抽提质粒DNA与鉴定85

实验十五 DNA的限制性内切酶消化88

实验十六 琼脂糖电泳检测DNA89

实验十七 PCR技术扩增枯草杆菌deoD基因91

实验十八 重组T质粒的构建93

实验十九 感受态的制备和转化94

实验二十 重组质粒的鉴定——菌落PCR97

第二章 培养基配制与灭菌99

第一节 培养基的配制99

（一）微生物的营养需求及对物质的吸收99

（二）培养基102

（三）培养基的配制107

第二节 高压蒸汽灭菌111

（一）灭菌与消毒的基本概念111

（二）高压蒸汽灭菌的原理113

（三）高压灭菌设备116

实验二十一 培养基的配制118

实验二十二 高压灭菌锅的使用121

第三章 摇瓶发酵124

第一节 发酵原理124

（一）营养124

（二）温度126

（三）pH126

（四）溶氧127

第二节 摇瓶发酵实验128

实验二十三 接种工具的认识与灭菌128

实验二十四 接种和移种130

实验二十五 枯草芽孢杆菌生产腺苷132

实验二十六 重组大肠杆菌羧肽酶的表达135

实验二十七 洛伐他汀发酵137

实验二十八 林可霉素发酵140

实验二十九 四环素类抗生素定向发酵142

实验三十 β-半乳糖苷酶生成的调节145

实验三十一 芽孢杆菌发酵产碱性蛋白酶148

第四章 发酵生化参数的测定151

第一节 生化参数测定原理151

第二节 生化参数分析方法154

实验三十二 比浊法测定发酵液中大肠杆菌浓度154

实验三十三 测定菌体干重155

实验三十四 紫外分光光度法定量测定细胞总核酸156

实验三十五 红霉素效价的化学法测定一157

实验三十六 红霉素效价的化学法测定二158

实验三十七 红霉素生物效价的测定159

实验三十八 二剂量法测定林可霉素生物效价161

实验三十九 利福霉素化学效价的测定164

实验四十 柠檬酸含量测定一165

实验四十一 柠檬酸含量测定二167

实验四十二 衣康酸含量测定168

实验四十三 丙酮酸含量测定170

实验四十四 用SBA-40C型生物传感分析仪测定谷氨酸和谷氨酰胺172

实验四十五 华勃氏呼吸仪测定谷氨酸的含量174

实验四十六 双缩脲法测定蛋白质含量177

实验四十七 Folin-酚法测定蛋白质浓度178

实验四十八 考马斯亮蓝法测定蛋白质浓度180

实验四十九 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）检测蛋白表达和测定蛋白质相对分子质量181

实验五十 发酵液中糖含量的测定184

实验五十一 DNS法测定还原糖浓度187

实验五十二 酶试剂盒法测定葡萄糖含量188

实验五十三 SBA-40型谷氨酸（乳酸）-葡萄糖双功能分析仪测定葡萄糖含量189

实验五十四 发酵液氮含量的测定192

实验五十五 靛酚蓝法测定铵离子193

实验五十六 钼酸铵法测定无机磷195

实验五十七 还原法测定无机磷196

实验五十八 钼钒法测定无机磷198

实验五十九 无细胞抽提液的制备199

实验六十 葡萄糖激酶的酶活测定200

实验六十一 磷酸果糖激酶的测定202

实验六十二 异柠檬酸脱氢酶活力测定204

实验六十三 6-磷酸葡萄糖脱氢酶的测定205

实验六十四 丙酮酸激酶活力测定207

实验六十五 柠檬酸合成酶活力测定209

实验六十六 碱性磷酸酶（AKP）酶活测定210

实验六十七 脂肪酶活力测定212

实验六十八 碱性蛋白酶活力测定214

实验六十九 酰基激酶活力的测定216

实验七十 酰基CoA合成酶活力的测定217

第五章 色谱分析在发酵工程中的应用220

第一节 色谱分析概述220

（一）气相色谱法的特点220

（二）气相色谱分离条件的选择221

（三）液相色谱法的特点223

（四）高效液相色谱分析方法的建立224

第二节 色谱法在发酵工程中的应用226

（一）反相HPLC双检测器法同时测定发酵液中的有机酸与葡萄糖226

（二）AQC柱前衍生高效液相色谱法测定发酵液中21种氨基酸228

（三）利用反相高效液相色谱法测定发酵液中的生物素含量230

（四）利用乙腈作为内标气相色谱法快速测定发酵液中的乳酸232

第六章 过程工程参数测定234

第一节 微生物反应器的混合原理234

第二节 微生物反应器的氧传递过程原理236

实验七十一 亚硫酸钠氧化法测定氧传递系数KLa238

实验七十二 用溶氧电极法的动态法测定氧传递系数KLa240

实验七十三 混合时间测定242

第二部分 综合实验247

第七章 微生物培养247

实验一 ε-聚赖氨酸生产菌株的选育与发酵工艺的研究247

实验二 D-核糖发酵250

实验三 重组大肠杆菌发酵人铜锌超氧化物歧化酶的高密度、高表达254

实验四 黑曲霉产纤维素酶液体发酵256

实验五 拟干酪乳杆菌发酵生产乳酸261

实验六 嘌呤核苷磷酸化酶在大肠杆菌中表达和酶学性质测定265

实验七 酶催化蔗糖转化反应269

实验八 酵母培养中的基质代谢、呼吸和生长的参数检测与参数相关分析275

实验九 酵母菌厌氧乙醇发酵279

实验十 重组毕赤酵母高密度发酵表达植酸酶及其分离纯化283

第八章 动物细胞培养292

实验十一 造血细胞分离、集落培养及表型分析292

实验十二 动物细胞的培养和计数295

实验十三 细胞的冷冻和复苏298

参考文献300