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第1章 转染实验技术概述1

1.1转染实验技术简介1

1.1.1转染实验技术的概念1

1.1.2外源基因转染真核细胞的目的、意义1

1.2转染实验技术的分类及原理2

1.2.1病毒感染法2

1.2.2非病毒感染法3

1.3转染实验技术的应用5

1.4新材料与新技术在转染实验技术中的应用7

参考文献8

第2章 目的基因的获取9

2.1目的基因概述9

2.2化学合成法获取目的基因11

2.2.1磷酸二酯法12

2.2.2磷酸三酯法14

2.2.3亚磷酸三酯法15

2.2.4寡核苷酸连接法15

2.3基因组文库钓取目的基因17

2.4 cDNA文库钓取目的基因19

2.4.1 mRNA的分离纯化（过程）20

2.4.2双链cDNA的体外合成20

2.5 PCR获取目的基因24

2.5.1 PCR扩增DNA的基本原理24

2.5.2 PCR扩增产物的克隆26

2.5.3 PCR技术在目的基因制备中的应用27

2.6 RT-PCR法获取目的基因27

参考文献28

第3章 基因表达载体的选择29

3.1基因表达载体概述29

3.2基因表达载体分类31

3.3基因表达载体的遗传标记32

3.4常用原核基因表达质粒载体34

3.5常用真核基因表达质粒载体38

3.6病毒型表达载体42

3.6.1噬菌体载体43

3.6.2反转录病毒载体49

3.6.3腺病毒载体52

3.7可表达融合蛋白的载体54

3.7.1谷光甘肽S-转移酶（GST）融合蛋白载体54

3.7.2 pMALTM融合蛋白表达载体56

3.8基因表达载体的改造57

3.8.1报道基因的改造57

3.8.2启动子的研究57

3.8.3大容量载体57

参考文献58

第4章 重组子的构建与鉴定59

4.1限制性内切酶59

4.2黏断连接方法及重点技术60

4.2.1单酶切位点的连接60

4.2.2双酶切位点的连接61

4.2.3同工异源酶及同尾酶酶切位点的连接62

4.3平端连接方法及重点技术62

4.4酶切位点的改造和连接63

4.4.1黏断切口转化为平端切口的连接63

4.4.2人工接头的设计及人工黏断切口的制备63

4.4.3酶切位点的化学修饰64

4.5重组子的筛选与鉴定64

4.5.1表型水平筛选65

4.5.2分子水平鉴定66

参考文献68

第5章 化学转染方法将重组体导入真核细胞69

5.1磷酸钙共沉淀法69

5.1.1磷酸钙共沉淀法原理69

5.1.2转染试剂、材料69

5.1.3仪器设备70

5.1.4操作步骤70

5.1.5注意事项及影响因素72

5.2 DEAE-葡聚糖法转染73

5.2.1 DEAE-葡聚糖法转染原理73

5.2.2转染试剂73

5.2.3仪器设备74

5.2.4操作步骤74

5.2.5操作注意事项74

5.3脂质体介导的转染75

5.3.1脂质体介导的转染原理75

5.3.2转染试剂77

5.3.3仪器设备77

5.3.4操作步骤77

5.3.5操作注意事项78

5.4纳米材料介导的转染78

5.4.1纳米材料介导的转染原理79

5.4.2转染试剂79

5.4.3仪器设备79

5.4.4操作步骤79

5.4.5操作注意事项81

参考文献81

第6章 物理转染方法将重组体导入真核细胞82

6.1显微注射法转染82

6.1.1显微注射法原理83

6.1.2转染试剂83

6.1.3仪器设备83

6.1.4操作步骤84

6.1.5操作注意事项85

6.2电穿孔法转染86

6.2.1电穿孔法转染原理86

6.2.2转染试剂87

6.2.3仪器设备88

6.2.4操作步骤89

6.2.5操作注意事项89

6.3基因枪转染90

6.3.1基因枪技术的发展历史90

6.3.2基因枪介导的转染原理和设备90

6.3.3转染试剂：微弹载体、DNA微载体92

6.3.4操作步骤93

6.3.5操作注意事项94

6.3.6基因枪技术作为新兴的转移基因的优点94

6.3.7基因枪的发展趋势94

参考文献95

第7章 病毒转染方法将重组体导入真核细胞96

7.1病毒转染系统概述96

7.2包装细胞概述96

7.3高浓度病毒原液的收集及滴度测定方法97

7.3.1高浓度病毒原液收集97

7.3.2病毒滴度测定方法97

7.4病毒转染的辅助系统98

7.4.1转染试剂98

7.4.2细胞状态98

7.4.3转染方法98

7.4.4载体构建100

7.5腺病毒介导的转染100

7.5.1腺病毒介导的转染原理100

7.5.2转染试剂101

7.5.3仪器设备104

7.5.4操作步骤105

7.5.5操作注意事项112

7.6反转录病毒介导的转染112

7.6.1反转录病毒介导的转染原理112

7.6.2转染试剂115

7.6.3仪器设备116

7.6.4操作步骤116

7.6.5操作注意事项118

参考文献119

第8章 转染成功细胞的选择120

8.1遗传报道基因系统120

8.1.1报道基因系统概述120

8.1.2报道基因的分类及使用选择122

8.1.3报道基因技术的前景展望123

8.1.4常见的报道基因124

8.2报道基因的同位素分析法127

8.2.1放射性同位素的基本性质128

8.2.2射线的防护128

8.3报道基因的非同位素分析法129

8.3.1酶联免疫法（ELISA）129

8.3.2荧光法133

8.3.3免疫组织化学染色法133

参考文献135

第9章 转染技术的应用137

9.1转基因动物及基因敲除动物137

9.1.1转基因动物的定义137

9.1.2制备转基因动物的方法137

9.1.3基因敲除动物138

9.2转基因植物139

9.2.1转基因植物的定义139

9.2.2常用的植物转基因方法139

9.2.3转基因植物的主要应用方向140

9.3基因制药140

9.3.1基因制药概述140

9.3.2基因工程药物生产的基本过程141

9.3.3基因制药技术的主要应用141

9.4基因治疗142

9.4.1遗传性疾病的基因治疗142

9.4.2肿瘤基因治疗143

9.4.3其他疾病的基因治疗143

9.5 RNA干扰治疗143

9.5.1在骨病治疗中的应用144

9.5.2在神经系统疾病中的应用144

9.5.3在肿瘤治疗中的应用145

9.5.4在抗病毒治疗中的应用145

9.5.5在皮肤病治疗中的应用145

参考文献146