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第一篇 激光扫描共聚焦显微镜基本原理3

第一章 激光扫描共聚焦显微镜原理3

第一节 概述3

一、共聚焦方法的发展3

二、激光扫描共聚焦显微镜的结构5

三、共聚焦显微镜图像模式6

第二节 标本制备和图像采集11

一、物镜11

二、荧光探针13

三、自发荧光14

四、图像采集15

五、故障排除16

六、图像处理和出版17

第三节 相关资讯17

第二章 图像采集19

一、三维图像构建19

二、材料20

三、方法22

一、测量前的准备工作29

第三章 激光扫描共聚焦显微镜的测量29

二、深度和厚度测量30

三、长度、面积和体积的测量31

四、荧光强度的测量32

第四章 图像的三维重建35

一、材料35

二、方法35

第五章 图像的信息管理41

一、数据库的类型41

二、图像数据的存储42

三、数据库的建立43

四、图像保存以及图像格式44

第六章 图像变形技术和数字电影46

一、材料46

二、方法48

三、注意事项51

第七章 细胞体积的原位动态测量53

一、材料53

二、方法54

三、注意事项63

一、钙代谢简述67

第一节 钙的转运及其机制67

第二篇 激光扫描共聚焦显微镜应用67

第八章 钙转运的机制和细胞内钙的测定67

二、血钙的转运及其调节68

三、细胞钙及其转运70

四、钙与细胞代谢反应调节75

第二节 细胞内钙的测定76

一、化学荧光指示剂77

二、生物发光钙指示剂80

三、指示剂负载方法81

四、钙指示剂的定标和估计83

五、Ca2+指示剂的潜在问题及解决办法85

六、测量Ca2+的技术87

七、测量Ca2+的步骤及注意事项88

第九章 分泌作用的钙离子控制90

第一节 细胞外分泌机制90

一、SNARE假说90

二、Ca2+和Ca2+粘结蛋白在调节分泌中的作用90

四、胞内钙池91

五、钙依赖分泌91

三、Ca2+通道91

第二节 研究分泌的方法92

一、完整细胞、渗透细胞和无细胞系统92

二、单个细胞92

第三节 分泌过程中胞内Ca2+测定93

一、完整细胞93

二、渗透细胞和无细胞系统95

第四节 分泌时胞内钙测量97

一、平均Ca2+浓度97

二、限定亚细胞区域的Ca2+浓度98

第十章 细胞亚组分的分离和细胞内钙库研究99

第一节 非肌细胞99

一、Ca2+库的位置99

二、Ca2+库的纯化技术100

三、Ca2+库的性质105

第二节 肌细胞107

一、Ca2+库的定位107

二、Ca2+库的纯化技术107

三、Ca2+库的性质109

一、Ca2+信号的胞内成分112

第一节 钙信号112

第十一章 研究钙信号的蟾蜍卵母细胞112

二、Ca2+释放113

三、钙诱导的钙释放113

四、用蟾蜍属卵母细胞研究钙信号的优点114

第二节 钙信号的控制114

一、肌浆网钙－ATP酶（SERCA）和钙信号114

二、钙释放控制和钙网硬蛋白摄取115

三、钙释放的线粒体控制116

第三节 蟾蜍属卵母细胞系统的实际操作方法117

一、材料121

第十二章 细胞内pH及pCa测定121

二、方法122

第十三章 钙调蛋白依赖蛋白激酶的激活125

第一节 钙调蛋白依赖蛋白激酶126

一、钙调蛋白激酶126

二、钙调蛋白激酶的三维结构127

三、CaM结合于钙调蛋白激酶128

四、CaM的C端结构域与蛋白激酶疏水端保守序列的相互作用128

五、CaM的124位蛋氨酸调节钙调蛋白激酶的活性129

七、CaM依赖激酶与CaM之间的氢键和静电作用对CaM依赖激酶活化的调节130

六、CaM的N端结构域中疏水残基对不同CaM依赖性蛋白激酶的影响130

一、CaM与CaM结合肽相互作用的Ca2+依赖性131

二、酶结合的Ca2+依赖和CaM的激活131

第二节 Ca2+在CaM依赖的蛋白激酶调节中的作用131

第十四章 钙通道的分子生物学134

第一节 克隆储存操纵通道的策略134

第二节 果蝇TRP和TRPL蛋白的同族体135

一、RT-PCR识别哺乳动物TRP同族体135

二、通过数据库分析识别TRP相关基因136

四、哺乳动物TRP蛋白的初级结构和跨膜结构138

三、TRP蛋白的多样性138

五、TRP同族体的组织特异性表达139

六、哺乳动物TRP通道功能性表达相关的方法142

第十五章 海胆受精成像143

一、材料143

二、方法144

第十六章 完整胚胎活细胞共聚焦成像148

第一节 材料和方法148

一、材料148

二、方法149

三、注意事项151

第二节 激光扫描共聚焦显微镜在哺乳动物胚胎发育研究方面的应用155

第十七章 用荧光探针进行基因表达分析157

一、材料158

二、方法158

第十八章 果蝇荧光原位杂交单标和双标方法164

一、材料164

二、方法165

一、材料170

第十九章 用蛋白荧光标记技术进行活体共聚焦分析170

二、方法171

三、注意事项175

第三篇 荧光探针及其应用技术179

第二十章 荧光探针的发展简史179

第一节 荧光染色和荧光探针179

一、荧光染色179

二、荧光的发射原理179

三、荧光与荧光物质的分子结构179

第二节 染料的合成及荧光染料的早期应用180

四、荧光探针180

第三节 荧光探针在活细胞中的应用和发展181

第四节 体内荧光探针182

第二十一章 荧光探针的性质及滤光片的选择183

第一节 荧光探针的性质183

一、激发波长和发射波长183

二、荧光强度183

三、荧光寿命183

四、光稳定性183

六、染料分子对环境的敏感性184

五、染料分子间的相互作用184

第二节 滤光片的选择185

一、常用的光源185

二、滤光片的分类185

三、滤光片的选择原则186

第三节 荧光抗衰减剂的选择190

一、常用的抗荧光衰减剂190

二、抗荧光衰减（淬灭）试剂盒191

第二十二章 荧光探针及其染色技术193

第一节 荧光探针负载（染色）原则及注意事项193

二、显微注射法194

一、酯化荧光探针染色法194

第二节 常用的染色方法194

三、透膜剂法195

第三节 常用荧光探针的染色方法195

一、BCECF测定pH值195

二、SNARF-1定量比率测定pH值195

三、Indo-1测定细胞内Ca2+195

七、Rhodamine 123标记活细胞线粒体196

六、DiBAC4测定细胞膜电位196

五、CFDA测定细胞间通讯196

四、Fluo-3测定细胞内Ca2+196

八、AO显示RNA和DNA197

九、PI显示DNA197

第四节 荧光探针的校正197

第二十三章 常用荧光探针198

第一节 测定细胞活性的荧光探针198

一、细胞活性和细胞毒性试剂盒198

二、活细胞探针200

三、死细胞探针202

第二节 膜荧光探针203

一、膜脂的特点和膜探针的应用204

二、膜流动性测定的荧光探针204

三、荧光基团标记的磷脂205

四、阴离子膜探针213

五、阳离子膜探针219

六、其他非极性和双亲性膜探针223

第三节 细胞器探针227

一、线粒体探针228

二、溶酶体、酵母菌液泡和其他酸性细胞器探针238

三、内质网和高尔基复合体探针241

第四节 pH荧光探针246

一、近中性pH应用的探针246

二、酸性pH使用的探针251

三、pH探针交联物253

第五节 细胞骨架蛋白荧光探针255

一、肌动蛋白荧光探针256

二、微管蛋白和其他细胞骨架蛋白探针266

第二节 激光扫描共聚焦显微镜常用的荧光探针271

一、选择荧光探针的一般考虑271

二、使用荧光探针的注意事项271

第二十四章 荧光探针的选择和应用271

第一节 选择荧光探针的注意事项271

一、细胞内游离钙272

二、DNA和RNA272

三、膜电位272

六、细胞间通讯273

七、细胞膜流动性273

八、细胞亚微结构（细胞器）探针273

五、细胞内活性氧273

四、pH值273

九、标记抗体、配体等常用的荧光探针274

十、检测酶活性的荧光探针274

第三节 激光扫描共聚焦显微镜中荧光探针的使用274

一、购买荧光探针的一般考虑275

二、探针选择275

三、荧光探针到达后的保存276

四、将荧光探针制备成溶液276

五、探针溶液的储存277

六、做好背底检查277

八、荧光信号的检测278

七、标记278

九、光漂白279

十、环境影响因素280

十一、仪器因素280

十二、以FITC作为LSCM探针的例子281

第四节 使用花青类染料进行LSCM荧光双标记281

第二十五章 常用组织学技术283

第一节 免疫荧光组织化学细胞和组织标本的制备283

一、细胞标本的取材283

一、固定的目的284

二、固定剂284

第二节 细胞和组织的固定284

二、组织标本的取材284

三、固定方法286

第三节 组织切片技术287

一、冰冻切片287

二、石蜡切片288

三、振动切片288

四、塑料切片288

一、一般光学显微镜术289

第四节 常用组织学研究方法289

七、玻片处理和涂胶289

六、碳蜡切片289

五、超薄切片289

二、几种特殊显微镜的应用290

三、组织化学和细胞化学术291

四、免疫细胞化学术291

五、放射性核素示踪术292

六、原位杂交术293

七、细胞和细胞化学定量术293

九、组织培养术294

八、电子显微镜术294

十、细胞融合术295

第二十六章 免疫荧光细胞化学技术296

第一节 有关的免疫学基础理论297

一、抗原、抗体的概念及抗原抗体的关系297

二、抗原的性质和种类297

三、抗体的性质和种类298

四、抗原与抗体的反应299

五、抗体形成的机制300

一、直接法301

第二节 免疫荧光细胞化学的基本原理301

六、补体系统301

二、间接法302

三、补体法302

四、双重免疫荧光标记法302

五、对照实验303

第三节 荧光抗体的制备303

一、荧光素303

二、荧光素标记抗体的方法304

三、荧光抗体质量控制307

一、标本制作309

二、荧光抗体染色方法309

四、荧光抗体的保存309

第四节 免疫荧光细胞化学染色方法309

三、荧光抗原染色法310

第五节 荧光显微镜检查法311

一、荧光显微镜311

二、荧光显微镜标本制作要求313

三、使用荧光显微镜的注意事项313

二、消除非特异性染色的方法314

一、非特异性染色的主要因素314

四、荧光图像的记录方法314

第六节 非特异性染色的消除方法314

第二十七章 亲合组织化学技术317

第一节 抗生物素－生物素免疫细胞化学染色法317

一、基本原理317

二、几种抗生物素－生物素染色法317

第二节 葡萄球菌蛋白A（SPA）319

一、SPA的性质320

二、SPA的应用320

三、SPA在免疫细胞化学染色中的应用321

二、凝集素的应用322

第三节 凝集素322

一、凝集素的特性322

三、凝集素在免疫细胞化学中的应用324

四、HRP标记凝集素及凝集素抗体的制备325

第四节 免疫细胞化学技术的某些进展326

第四篇 共聚焦显微镜技术在植物学研究中的应用329

第二十八章 植物细胞样品制备329

第一节 植物细胞的特点329

一、细胞壁329

一、材料330

第二节 材料和方法330

二、液泡330

三、叶绿体330

二、方法332

第二十九章 植物细胞骨架研究339

第一节 植物细胞中细胞骨架结构的共聚焦显微镜观察339

一、植物微管阵列的观察339

二、植物微丝骨架的共聚焦显微镜观察340

第二节 植物细胞骨架动态的共聚焦显微镜观察341

一、荧光类似物细胞化学法341

三、植物细胞骨架的三维图像构建341

二、荧光漂白恢复技术342

第三节 绿色荧光蛋白（GFP）与共聚焦显微镜观察343

第四节 植物材料共聚焦显微镜观察的制片方法343

一、植物材料制片中需注意的问题343

二、植物材料的制片步骤344

附录一 细胞生物学名词解释348

附录二 免疫细胞化学常用试剂及其配制方法352

参考文献365

彩 图373