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1真核基因转录调控的基础知识1

引言1

基因调控的基本模型2

概念和策略：Ⅰ．启动子和基本转录机构5

前言7

目 录7

核心启动子结构8

绪言9

基本转录机构10

TAFⅡ12

缩略词13

全酶和中介体14

概念和策略：Ⅱ．激活因子和抑制因子20

调控性启动子和增强子20

转录激活因子21

抑制因子和共抑制因子25

概念和策略：Ⅲ．染色质和基因调控26

染色质26

ATP依赖型重建复合体29

染色质的乙酰化32

组蛋白去乙酰化、转录抑制和转录沉默34

基因座控制区、绝缘子和基质附着区37

联合调控、协同性和协同作用40

概念和策略：Ⅳ．增强体40

增强体理论41

IFN-β增强体42

激活作用的生化机制43

展望44

2初始策略53

引言53

概念和策略54

基因调控分析的首要步骤54

达到特定目标所需投入的时间和资源56

论证分析的可行性59

进行转录调控分析62

总结63

3 mRNA丰度的调控模式65

引言65

概念和策略66

转录起始与mRNA稳定性66

转录延伸78

前体mRNA差异剪接、mRNA的转运和多聚腺苷酸化85

技术87

方案3.1核连缀转录分析87

4转录起始位点的定位96

引言96

初始阶段需要考虑的问题98

概念和策略98

引物延伸99

RNase保护104

S1核酸酶分析107

cDNA末端的快速扩增111

技术115

方案4.1引物延伸分析115

方案4.2 RNase保护分析121

方案4.3 S1核酸酶分析127

5启动子的功能性分析方法133

引言134

分析方法的选择：各种分析方法的优缺点139

概念和策略139

瞬时转染分析143

通过染色体整合的稳定转染分析159

技术167

哺乳动物细胞的常用转染方法167

方案5.1 3T3成纤维细胞的磷酸钙转染168

方案5.2淋巴细胞系的DEAE－葡聚糖转染170

方案5.3 RAW264.7巨噬细胞的电穿孔转染172

常用的报道酶分析法174

方案5.4荧光素酶分析174

方案5.5氯霉素乙酰转移酶分析176

方案5.6β－半乳糖苷酶分析178

6远距离调控区的鉴定和分析184

引言184

概念和策略186

DNaseⅠ超敏感性分析186

基质附着区的鉴定191

远距离调控区的功能性分析法192

用于表征远距离调控区的功能性分析法196

7鉴定调控区中的顺式作用DNA元件204

引言204

通过综合性突变分析鉴定调控元件206

概念和策略206

利用体内或体外蛋白质－DNA相互作用鉴定调控元件227

通过数据库分析鉴定调控元件228

诱变技术229

8 DNA结合蛋白的鉴定及其基因的分离242

引言242

鉴定DNA结合蛋白的概念和策略244

数据库检索法244

粗制细胞裂解物的蛋白质－DNA相互作用分析方法的建立245

克隆编码DNA结合蛋白基因的概念和策略265

通过蛋白质纯化法和肽序列分析法进行克隆268

通过不需要进行蛋白质－DNA相互作用分析的方法进行克隆276

引言284

9确证蛋白质－DNA相互作用的功能相关性284

概念和策略286

体外蛋白质－DNA复合体的丰度286

DNA结合蛋白和靶基因的相对表达模式288

蛋白质结合所需核苷酸和调控元件活性所需核苷酸的相关性289

DNA结合蛋白的过量表达对报道基因或内源基因的反式激活290

与相邻调控区相结合的蛋白质间协同结合和协同效应292

基因组足迹模式和体外足迹模式的比较294

蛋白质－DNA相互作用的相对亲和力295

基因剔除或反义实验297

显性失活突变体298

体外转录方法301

体内蛋白质－DNA交联303

改变特异性的实验306

10内源调控区的体内分析311

引言311

概念和策略313

序列特异性蛋白质－DNA相互作用的体内分析313

核小体的定位和重建318

DNA甲基化328

基因的亚核定位328

技术329

方案10.1 MNase-Southern印迹分析法329

方案10.2 LM-PCR方法337

引言355

11合成重组转录因子的方法355

概念和策略357

原核表达体系357

克服E.coli中表达问题的策略365

合成大的调控蛋白367

合成小量的粗制蛋白质378

大分子复合体的合成与纯化381

适当表达体系的选择383

12鉴定和分析转录因子结构域389

引言389

诱变的基本原理390

概念和策略：定义结构域390

基因激活因子的结构域392

分离激活因子的DNA结合结构域和激活结构域393

DNA识别亚结构域和寡聚化亚结构域的划分399

概念和策略：蛋白质－蛋白质相互作用402

激活结构域和共激活因子及通用因子的相互作用402

亲和层析403

改变特异性的遗传体系407

基本转录机构的结构－功能分析409

技术413

方案12.1 PCR介导的定点诱变413

引言423

13调节性转录因子结合DNA的理论、特征和模型423

概念和策略426

DNA－蛋白质相互作用的基本理论和实例426

DNA－蛋白质相互作用的分析和模型439

启动子特异性多组分核蛋白复合体的分析456

技术463

方案13.1 DNaseⅠ足迹法463

方案13.2羟自由基足迹法473

方案13.3磷酸乙基化干扰分析476

方案13.4甲基化干扰分析479

方案13.5电泳迁移率变动分析483

方案13.6制备32p末端标记的DNA片段487

14用于体外转录分析的粗制系统和分级分离系统496

引言497

概念和策略498

抽提物的制备498

转录分析501

分级分离系统510

技术518

核抽提物和全细胞抽提物的制备518

方案14.1Dignam和Roeder法制备核抽提物519

方案14.2从大鼠肝中制备核抽提物523

方案14.3制备全细胞抽提物528

转录530

体外转录分析530

方案14.4利用HeLa细胞抽提物和引物延伸法进行体外530

方案14.5利用HeLa细胞核抽提物进行无G序列盒体外536

转录536

转录因子的纯化539

方案14.6粗制分级分离系统的制备541

方案14.7重组TFIIB从E.coli中的纯化546

方案14.8重组TFIIA的纯化550

方案14.9RNA PolⅡ的亲和纯化552

方案14.10已附加表位的TFIID的纯化556

引言567

15研究转录复合体组装的方法567

概念和策略569

基本前起始复合体的形成569

开放复合体的形成、起始和启动子撤离576

活化的复合体在启动子处的组装583

技术592

方案15.1 PolⅡ开放复合体的高锰酸钾探测592

方案15.2与DNA相结合的TFIID的镁－琼脂糖EMSA596

附录605

附录1注意事项605

附录2供应商610

附录3商标611